HODNOCENÍ VIABILITY BUNĚK TRYPANOVOU MODŘÍ

 

Živé a mrtvé buňky je možno rozlišit barvením. U buněk s narušenou plazmatickou membránou dochází k hromadění barviva a tím k obarvení buňky, nepoškozené živé buňky zůstávají neobarvené. Nejčastěji používanými metodami jsou barvení trypanovou modří a barvení fluoreskujícím propidium jodidem. Test vylučování trypanové modři je používán pro určení porušení strukturální integrity buněčné membrány. Barvivo nemůže vstoupit do buněk s neporušenou buněčnou membránou (živých buněk), proto tyto buňky zůstávají neobarvené. Pro prostup barvy musí být buněčná membrána již značně poškozená (mrtvé buňky), makromolekuly barviva těmito mezerami prochází a buňku obarví modře.

Roztoky

Phosphate-buffered saline (1x PBS)

NaCl                                                                                     8 g

KCl                                                                                       0.2 g

Na2HPO4                                                                               1.42 g

KH2PO4                                                                                 0.24 g

pH upraveno na                                                                     7.4

Přidat dH2O do                                                                      1 litr

 

Trypanová modř

0.2% roztok v PBS

 

Potřebné přístroje

         Mikroskop Olympus CKX41

Materiál

         Bürkerova komůrka

 

Postup hodnocení viability

1)                      Smícháme 50 μl vzorku s 50 μl 0.2% roztoku trypanové modři.

2)                      Kápneme 50 μl obarvené suspenze na sklíčko s mřížkou.

3)                      Přikryjeme krycím sklíčkem a hodnotíme pod mikroskopem.

4)                      Zhodnotíme poměr živých buněk (neobarvené, silně světlolomné) a mrtvých                                  buněk (modré) z celkového počtu 100 hodnocených buněk na vzorek.

HODNOCENÍ BUNĚČNÉ PROLIFERACE, VIABILITY A CYTOTOXICITY KOLORIMETRICKOU METODOU WST-1

Kolorimetrická metoda WST-1 je metoda, při které jsou tetrazoliové soli živých buněk metabolizovány mitochondriálními dehydrogenázami na formazan. Bunky inkubujeme s roztokem WST-1 (4-[3-(4-Iodofenyl)-2-(4-nitrofenyl)2H-5-tetrazolio]-1,3-benzen) 2h při 37°C na 96-jamkových destičkách a poté změříme absorbanci na spektrofotometru při 440 nm a při referenční vlnové délce 620 nm (referenční délka má být více než 600 nm – tam mají WST-1 i formazan stejnou absorpci).

 

Chemikálie a roztoky

Cell proliferation reagent WST-1 (ROCHE Cat. No. 05015944001) (Colorimetric assay for the quantification of cell proliferation, cell viability, and cytotoxicity)

Neotevřená lahvička vydrží skladovaná při -15 až -25°C chráněna před světlem do data expirace. Po rozmražení skladujeme při +2 až +8°C, chráněné před světlem. Takto vydrží několik týdnů. Pro delší skladování je lépe skladovat alikvoty zamražené při -15 až -25 °C.

 

Etoposid (Mr=588.6)

Připravit zásobní 20 mM roztok v DMSO: 11.8 mg/ml DMSO. Pro test cytotoxicity použít 2.5 µl, resp. 5 µl zásobního roztoku.

EOM (extractable organic mass) pro aplikaci

EOM naředíme na zásobní roztok 10 µg/µl v DMSO, zásobní roztok pak dále ředíme pomocí DMSO na pracovní roztoky:2.5 µg/µl, 1 µg/µl, 0.1 µg/µl.

Pro test cytotoxicity použijeme vždy 10 µl příslušného pracovního roztoku.

 

Potřebné přístroje a materiál

Inkubátor Jouan IG150 (37°C)

Centrifuga Eppendorf 5810 R

Spektrofotometr na mikrotitrační destičky Spectra Max M5e

Mikroskop Olympus CKX41

Bürkerova komůrka

Multikanálová pipeta Eppendorf (10, 50, 100 ul)

96-jamkové destičky, sterilní špičky

 

Postup hodnocení cytotoxicity

  1. Napěstujeme buňky na 96-jamkové destičce v koncentraci 1 x 104 / jamku ve 100 ul media.
  2. Přidáme 10 μl / jamku reagentu WST-1.
  3. Inkubujeme buňky 2 h v inkubátoru 37°C.
  4. Řádně protřepeme na třepačce 1 min.
  5. Změříme absorbanci vzorků při 440 nm. Poté změříme absorbanci při 620 nm (referenční vlnová délka, která by měla být více než 600 nm – tam mají WST-1 i formazan stejnou absorpci).

Postupy stanovení DNA aduktů v textové podobě ke stažení:

Cytotoxicity testy MEDETOX CZ
Název: Cytotoxicity testy MEDETOX CZ
Titulek: Postup pro stanovení cytotoxicity ve formátu doc
Filename: Cytotoxicity-testy-MEDETOX-CZ.doc
Velikost: 37 kB
Cytotoxicity testy MEDETOX CZ
Název: Cytotoxicity testy MEDETOX CZ
Titulek: Postup pro stanovení cytotoxicity ve formátu odt
Filename: Cytotoxicity-testy-MEDETOX-CZ.odt
Velikost: 32 kB
Cytotoxicity testy MEDETOX CZ
Název: Cytotoxicity testy MEDETOX CZ
Titulek: Postup pro stanovení cytotoxicity ve formátu pdf
Filename: Cytotoxicity-testy-MEDETOX-CZ.pdf
Velikost: 99 kB