ANALÝZA MARKERŮ OXIDAČNÍHO POŠKOZENÍ DNA, PROTEINŮ A LIPIDŮ PO IN VITRO APLIKACI LÁTEK NA BUNĚČNÉ KULTURY HEL a A549

O B S A H

  1. Aplikace testovaných látek na buněčné kultury
  2. Oxidační poškození DNA stanovené metodou ELISA
  3. Detekce 8-oxodG v DNA
  4. Oxidační poškození proteinů a lipidů
    1. Příprava buněčných lyzátů
    2. Stanovení koncentrace proteinů
    3. Stanovení oxidace proteinů v buněčných lyzátech metodou ELISA (karbonyl ELISA)
    4. Stanovení koncentrace 15-F2t-isoprostanu v buněčných lyzátech metodou ELISA
      (kit firmy Cayman, kat. č. 516351)

1. Aplikace testovaných látek na buněčné kultury

  1. Buňky kultivujeme v 75 cm2 lahvích s 15-30 ml kultivačního média (S 10% FCS) do 80-90% konfluence.
  2. Nahradíme médium 10 ml čerstvého média s 1% fetálního séra (FCS), přidáme testované látky a inkubujeme příslušnou dobu v inkubátoru (37°C).
  3. Buňky seškrábeme pomocí škrabky, převedeme do 15 ml zkumavky a opláchneme kultivační láhev 5 ml roztoku PBS (pH 7,4).
  4. Zcentrifugujeme 3000 ot./min, 5 min. při 4 °C.
  5. Odsajeme supernatant, resuspendujeme ve 13 ml PBS (pH 7,4) a opakujeme krok 4.
  6. Odsajeme supernatant, resuspendujeme ve 4 ml PBS (pH 7,4), odebereme 1 ml do mikrozkumavky označené názvem projektu Medetox a číslem vzorku (suspenze bude použita pro stanovení oxidace proteinů a peroxidaci lipidů), zbylou suspenzi ponecháme v 15 ml zkumavce.
  7. Zopakujeme krok 4, odsajeme supernatant a uchováme pelety při -70 °C, dokud nebude provedena analýza.

 

2. Oxidační poškození DNA stanovené metodou ELISA

Roztoky

Deferoxamine mesylate (DFA) (100 ml)

0.1 mM deferoxamine mesylate (MW=656.8)               6.6 mg

Skladovat při 4 °C.

 

50 mM Tris

Trizma-base                                                             1.21 g

0.1 mM DFA                                                             200 ml

Upravit pH na 7.4, skladovat při 4 oC.

 

Extrakční pufr

Trizma-base (MW 121.1)                                           2.42 g

EDTA (MW 372.3)                                                    3.72 g

SDS-Sodiumdodecylsulphate (MW 268.4)                   10.0 g

Deferoxamine mesylate                                             66 mg

dH2O                                                                      1.0 litr

Skladovat při 4 °C

 

RNáza mix

Ribonuclease A (Sigma, R-5125)                                10 mg

50 mM Tris                                                                 1 ml

Smíchat a inkubovat 10 min při 80 °C. Ochladit a napipetovat do lahvičky s Ribonuclease T1 (5000 u/ml, Sigma, R-1003), jemně promíchat. Rozdělit do mikrozkumavek a skladovat při -20 °C.

 

Proteináza K

10 mg/ml 0.1 mM DFA (for 40U/mg)

Připravit před použitím

 

5M NaCl

NaCl                                                                         29.23g

0.1 mM DFA                                                              100 ml

Skladovat při 4 °C

 

CI  (poměr 24 : 1)

Chloroform                                                                240 ml

3-methyl-1-butanol                                                    10 ml

Smíchat a přidat 80 ml of 50 mM Tris, skladovat při 4 °C

Phosphate-buffered saline (1x PBS)

NaCl                                                                          8 g

KCl                                                                           0.2 g

Na2HPO4                                                                   1.42 g

KH2PO4                                                                     0.24 g

Upravit pH na 7.4

Přidat dH2O do                                                          1 litr

 

PBS-DFA (0.1 mM DFA in 1x PBS)

DFA                                                                          6.6 mg

1xPBS                                                                      100 ml

 

Postup izolace DNA pro analýzu 8-oxodG

  1. Zkumavky s peletami buněk vyjmeme z mrazáku a po rozmražení přidáme 1 ml extrakčního pufru, promícháme a přidáme 20 µl RNáza mix, inkubujeme 1 h při 37 °C.
  2. Ke každému vzorku přidáme 20 µl proteinázy K (5 mg/500 µl dH2O), inkubujeme 1,5 h při 37 °C.
  3. Převedeme supernatant do 15 ml zkumavek obsahujících Phase Lock Gel, přidáme stejný objem (1 ml) roztoku CI s antioxidantem a intenzivně promícháme.
  4. Centrifugujeme 5 minut při 3000 ot./min.
  5. Převedeme horní fázi do 15 ml zkumavky a vysrážíme DNA přidáním 5M NaCl (100 µl; 1/10 objemu) a ledově studeného etanolu (2.2 ml; 2 objemy), důkladně promícháme.
  6. Centrifugujeme 5 minut při 4000 ot./min. a převedeme DNA do mikrozkumavek pomocí špiček.
  7. Ke vzorkům v mikrozkumavkách přidáme 1 ml 70% etanolu a zcentrifugujeme 5 minut při 6000 ot./min.
  8. Vysušíme vzorky DNA ve vakuové odparce (20-25 min) a skladujeme při -70 °C, případně rozpustíme v roztoku PBS-DFA podle dále uvedeného postupu.
  9. Ke vzorkům DNA přidáme PBS-DFA (50-100 µl pro DNA izolované z 75 cm2 kultivačních lahví) a uchováme 30-60 min při 4 °C.
  10. Peletu DNA rozbijeme pomocí homogenizátoru (Pellet Pestle Motor, Sigma) a inkubujeme 40 min při 55 °C, v průběhu inkubace mícháme, aby se usnadnilo úplné rozpuštění DNA.
  11. Případné nerozpuštěné části pelety odstraníme centrifugací 2 minuty při 6000 ot./min. a převedením supernatantu do nové mikrozkumavky.
  12. Denaturujeme DNA 5 min při 100 °C, necháme schladnout 5 min při pokojové teplotě a fragmentujeme pomocí injekční stříkačky a jehly velikosti 22G.
  13. Roztok naředíme 20x (2 µl + 38 µl PBS) a změříme absorbanci při 260 nm a 280 nm. Upravíme koncentraci přidáním PBS-DFA na výslednou hodnotu 0.75 – 1.25 µg/µl.
  14. Roztok skladujeme při -70 °C.

 

3. Detekce 8-oxodG v DNA

Roztoky

Phosphate-buffered saline (PBS) (1000 ml)

NaCl                                                  8 g

KCl                                                   0.2 g

Na2HPO4                                           1.42 g

KH2PO4                                             0.24 g

pH 7.4

 

Promývací pufr

1x PBS                                              997.5 ml

10% NaN3                                          2 ml

Tween                                                500 ml

 

PBS/Tween

1x PBS                                              499.75 ml

Tween                                               250 ml

 

Blokovací roztok (1% FCS v PBS/Tween)

PBS/Tween                                        49.5 ml

FCS                                                   500 ml

 

1M diethanolamine

52.5 g in 500 ml dH2O

pH 8.6 pomocí konc. HCl

 

0.01M diethanolamine

1M diethanolamine                               1 ml

dH2O                                                  99 ml

 

PBS-DFA (0.1 mM DFA in 1x PBS)

DFA                                                    6.6 mg

1xPBS                                                 100 ml

 

Postup detekce 8-oxodG v DNA

 

  1. Vazba konjugátu 8-oxoG-BSA na mikrotitrační destičky (Corning Costar, cat. # 3690, Half Area Plates): použijeme 5 ng konjugátu 8-oxoG-BSA/jamku/25 ml PBS, přednostně použijeme jen 60 vnitřních jamek, inkubujeme při 37 °C přes noc, destičku nezakrýváme víčkem.
  2. Promyjeme destičku, blokujeme přidáním 100 ml blokovacího roztoku/jamku, 1 hod, při pokojové teplotě.
  3. Naředíme primární protilátku (JaICA, Japonsko; 1:500 (výsledná konc. 0.2 mg/ml) v blokovacím roztoku). Naředíme standard 8-oxodG (Sigma, cat. # H5653) v PBS a použijeme ho pro přípravu kalibrační křivky (koncentrace zásobního roztoku 8-oxodG je 1 mg/ml; 5 mg v 5 ml PBS):

8-oxodG (výsledná konc.)

8-oxodG (zásobní roztok, nebo předchozí ředění, µl)

PBS (µl)

10 µg/ml

10 (1 mg/ml)

990

100 ng/ml

10 (10 µg/ml)

990

80 ng/ml

800 (100 ng/ml)

200

60 ng/ml

600 (80 ng/ml)

200

40 ng/ml

480 (60 ng/ml)

240

20 ng/ml

400 (40 ng/ml)

400

10 ng/ml

400 (20 ng/ml)

400

5 ng/ml

200 (10 ng/ml)

200

2.5 ng/ml

200 (5 ng/ml)

200

1.25 ng/ml

200 (2.5 ng/ml)

200

 

Připravíme vzorky bez kompetitoru (určují celkovou vazbu protilátky na destičku, 25 ml PBS + 25 ml roztoku protilátku/jamku) a vzorky bez protilátky (blank, absorbance pozadí, 25 ml PBS + 25 ml blokovacího roztoku/jamku).

  1. Z destičky odstraníme blokovací roztok, přidáme 25 ml vzorků DNA (konc. 0.75–1.25 mg/ml) a standardů 8-oxodG, 50 ml vzorků bez kompetitoru a bez protilátky; po přidání vzorků a standardů připipetujeme 25 ml primární protilátky do všech jamek s výjimkou jamek bez kompetitoru a bez protilátky; inkubujeme 90 min při pokojové teplotě.
  2. Promyjeme destičku, přidáme sekundární protilátku (anti-mouse, alkaline phosphatase conjugated, Sigma, cat. # A-4656) (50 ml/jamku) naředěnou 1:750 v blokovacím roztoku a inkubujeme 90 min při pokojové teplotě.
  3. Promyjeme destičku, propláchneme roztokem 0.01M diethanolaminu, přidáme 50 ml substrátu (p-Nitrophenyl Phosphate, Disodium, 5 mg/tablet, Sigma) na jamku (2 tablety/10 ml of 1M diethanolaminu).
  4. Inkubujeme 20-60 min při pokojové teplotě, změříme absorbanci při 405 nm (absorbance jamek bez kompetitoru má být mezi 0,5-1,0).
  5. Vypočítáme koncentrace 8-oxodG ve vzorcích pomocí kalibrační křivky.

 

4. Oxidační poškození proteinů a lipidů

 

4.1. Příprava buněčných lyzátů

  1. Smícháme vzorek (minimální množství buněk: 0.5-1×106) s 50-100 µl CelLytic reagent (Sigma), inkubujeme 15 min při pokojové teplotě, opakovaně mícháme; centrifugujeme 15 min při 12,000 – 20,000 ot./min, 4 °C.
  2. Opatrně odebereme buněčný lyzát (supernatant), skladujeme při -70 °C; použijeme 5 µl lyzátu + 20 µl vody (ředění 5x) pro stanovení koncentrace proteinů.

 

4.2. Stanovení koncentrace proteinů

  1. Rozpustíme hovězí sérový albumin (BSA) ve vodě (konc. zásobního roztoku 30 mg/ml) a připravíme kalibrační křivku:

BSA (výsledná konc. mg/ml)

BSA (zásobní roztok, nebo předchozí ředění, µl)

Voda (µl)

3.0

100

900

2.5

500

100

2.0

400

200

1.5

300

100

1.0

200

100

0.5

150

150

0.0

0

300

  1. Naředíme analyzované vzorky ve vodě 5x (5 µl + 20 µl water).
  2. Smícháme bicinchoninic acid a CuSO4 (20 ml + 400 µl/mikrotitrační destičku).
  3. Napipetujeme na destičku v duplikátech 10 µl naředěných vzorků a standardů.
  4. Ke každému vzorku přidáme 200 µl roztoku bicinchoninic acid + CuSO4 a inkubujeme 30 min při 37 °C.
  5. Změříme absorbanci při 562 nm a s pomocí kalibrační křivky vypočítáme koncentraci proteinů ve vzorcích.

 

4.3. Stanovení oxidace proteinů v buněčných lyzátech metodou ELISA (karbonyl ELISA)

 

Roztoky pro metodu Karbonyl ELISA

PBS – 10mM sodium phosphate buffer v 140 mM NaCl – pH 7.0 (Coating buffer)

10mM Na2HPO4 (M.W. 141.96) = 1.4196 g/l

140mM NaCl (M.W. 58.44) = 8.1816 g/l

pH upravit na 7.0 pomocí HCl

 

0.1% BSA v PBS

100 mg BSA v 100 ml PBS, pH 7.0

 

0.1% BSA, 0.1% Tween 20 v PBS

100 mg BSA, 100 µl Tween 20 v 100 ml PBS, pH 7.0

 

Derivatizační roztok (100 ml) -10mM 2,4 DNPH, 6.0M Guanidine Hydrochloride, 0.5M Potassium Phosphate, pH 2.5

198 mg 2,4-DNPH v 3.33 ml konc. kyselině fosforečné (85%)

57.318 g guanidine hydrochloride ve 25 ml vody (nutno zahřát, aby došlo k úplnému rozpuštění)

Přidat po kapkách roztok 2,4- DNPH za současného míchání

Upravit pH na 2,5 pomocí 10M KOH, přidat vodu do 100 ml.

 

10x PBS pro promývací roztok (1000 ml)

NaCl                                                  80 g

KCl                                                    2 g

Na2HPO4                                            14.2 g

KH2PO4                                              2.4 g

Rozpustit v 800 ml destilované vody, upravit pH na 7.4, doplnit do 1000 ml.

 

 

Promývací roztok (5000 ml)

10x PBS promývací roztok                  500 ml

voda                                                 4500 ml

10% NaN3                                         10 ml

Tween-20                                          2.5 ml

 

2M TRIS

24.2 g ve 100 ml vody

 

2.5 M kyselina sírová

2.68 ml H2SO4 (98%)/100ml

 

Postup derivatizace proteinů

  1. S použitím standardu (oxidovaný BSA) připravíme kalibrační křivku. Naředíme zásobní roztok standardu (obsahuje asi 1,9-2,0 nmol karbonylových skupin/mg proteinu) pomocí PBS:

Konc. karbonylových skupin (nmol/mg proteinu)

Standard BSA (µl)

PBS (µl)

0.612

30

170

0.510

25

175

0.408

20

180

0.306

15

185

0.204

10

190

0.102

5

195

0

0

100

  1. Naředíme analyzované vzorky v PBS tak, aby výsledná koncentrace proteinů ve vzorcích byla 2 mg/ml; v případě, že koncentrace proteinů je příliš nízká, mohou být vzorky naředěny až na výslednou koncentraci 0,4 mg/ml.
  2. V mikrozkumavkách, nebo v 96-jamkových mikrodestičkách smícháme 10 µl derivatizačního roztoku (DNPH) a 10 µl vzorku naředěného v kroku 2; po naředění je výsledná koncentrace proteinů 1 mg/ml (příp. při nízké koncentraci 0,2 mg/ml).
  3. Inkubujeme vzorky při pokojové teplotě ve tmě po dobu 45 min, mícháme každých 10-15 minut.
  4. Zastavíme derivatizaci přidáním 30 µl (tj. 1,5 objemu) 2M Tris, zamícháme.
  5. Přidáme 5 µl derivatizovaných vzorků do 1 ml Coating buffer (příp. při nízké koncentraci proteinů použít  25 µl vzorku), celkový obsah proteinů ve vzorku je 2 µg; naředíme 12.5 µl standardu a 1 ml Coating buffer; vzorky promícháme a napipetujeme na mikrotitrační destičku; další postup viz níže.

 

Postup Karbonyl ELISA

  1. Napipetujeme 200 µl vzorků a standardů na mikrotitrační destičku (v duplikátech, nebo v triplikátech) a inkubujeme při 4 °C přes noc; jako blank použijeme derivatizovaný roztok PBS.
  2. Promyjeme destičku promývacím pufrem (350 µl/jamku) a blokujeme v 0.1% BSA/PBS (250 µl/jamku) 1,5 hod při pokojové teplotě.
  3. Promyjeme destičku a přidáme primární protilátku anti-DNP (ředění 1:1500 v 0.1% BSA/0.1% Tween 20/PBS; tj. 16.6 μl/25 ml pro 96-jamkovou destičku) (200 µl/jamku); inkubujeme 1 hod při 37 °C.
  4. Promyjeme destičku a přidáme konjugát streptavidin-křenová peroxidáza (ředění 1:4000 v 0.1% BSA/0.1% Tween 20/PBS; tj. 6.25 μl/25 ml pro 96-jamkovou destičku) (200 µl/jamku); inkubujeme 1 hod při pokojové teplotě.
  5. Promyjeme destičku, přidáme substrát TMB (200 µl/jamku) a inkubujeme při pokojové teplotě ve tmě po dobu 15-25 min.
  6. Zastavíme reakci přidáním 2.5M H2SO4 (100 µl/jamku).
  7. Změříme absorbanci při 450 nm, odečteme absorbanci blanku a pomocí kalibrační křivky vypočítáme koncentrace karbonylových skupin ve vzorcích.

 

4.4. Stanovení koncentrace 15-F2t-isoprostanu v buněčných lyzátech metodou ELISA (kit firmy Cayman, kat. č. 516351)

Postup purifikace vzorků a ELISA

  1. Napipetujeme buněčné lyzáty obsahující 50 µg proteinu do mikrozkumavek, přidáme vodu do objemu 100 µl, dále přidáme 100 µl of 15% KOH a inkubujeme 60 min při 40 °C.
  2. Upravíme pH přidáním 300 µl 1M KH2PO4 (výsledné pH ~ 7.3), přidáme 100 µl roztoku Column buffer (Cayman, kat. č. 416358) (celkový objem je 600 µl; původní vzorek je naředěn 5x), zamícháme.
  3. Přidáme 50 µl Isoprostane Affinity Sorbent (Cayman, kat. č. 416359), inkubujeme na třepačce 60 min při pokojové teplotě.
  4. Centrifugujeme 1 min při 4000 ot./min, opatrně slijeme supernatant.
  5. Přidáme 1 ml vody, zamícháme a centrifugujeme 1 min při 4000 ot./min, opatrně slijeme supernatant.
  6. Resuspendujeme sediment v 0,5 ml Elution Solution (95% etanol ve vodě), promícháme a centrifugujeme 1 min při 4000 ot./min.
  7. Supernatant přelijeme do nové mikrozkumavky; opakujeme promytí sedimentu v Elution Solution a spojíme oba supernatanty dohromady.
  8. Centrifugujeme 1 min při 4000 ot./min, převedeme supernatant do nové mikrozkumavky.
  9. Supernatant skladujeme při -70 °C až do doby analýzy. Případně okamžitě odpaříme ve vakuové odparce (trvá asi 2 hod), resuspendujeme ve 110 µl of EIA pufru (součást 8‑Isoprostane EIA kitu) a hned použijeme pro analýzu.
  10. Provedeme analýzu metodou ELISA podle návodu dodaného výrobcem (Cayman, 8‑Isoprostane EIA Kit, cat. # 516351).

Postupy a protokoly v textové podobě ke stažení:

Oxidacni stres in vitro MEDETOX CZ
Název: Oxidacni stres in vitro MEDETOX CZ
Titulek:
Filename: Oxidacni-stres-in-vitro-MEDETOX-CZ.doc
Velikost: 110 kB
Oxidacni stres in vitro MEDETOX CZ
Název: Oxidacni stres in vitro MEDETOX CZ
Titulek:
Filename: Oxidacni-stres-in-vitro-MEDETOX-CZ.odt
Velikost: 30 kB
Oxidacni stres in vitro MEDETOX CZ
Název: Oxidacni stres in vitro MEDETOX CZ
Titulek:
Filename: Oxidacni-stres-in-vitro-MEDETOX-CZ.pdf
Velikost: 122 kB
Oxidacni stres protokol MEDETOX CZ
Název: Oxidacni stres protokol MEDETOX CZ
Titulek:
Filename: Oxidacni-stres-protokol-MEDETOX-CZ.ods
Velikost: 23 kB
Oxidacni stres protokol MEDETOX CZ
Název: Oxidacni stres protokol MEDETOX CZ
Titulek:
Filename: Oxidacni-stres-protokol-MEDETOX-CZ.pdf
Velikost: 75 kB
Oxidacni stres protokol MEDETOX CZ
Název: Oxidacni stres protokol MEDETOX CZ
Titulek:
Filename: Oxidacni-stres-protokol-MEDETOX-CZ.xls
Velikost: 40 kB